在之前的文章中已經(jīng)探討了擴(kuò)增試劑、PCR儀、提取試劑乃至采樣拭子的評(píng)價(jià)方式。今天我們繼續(xù)探討PCR實(shí)驗(yàn)室最容易忽視的環(huán)節(jié)，對(duì)試驗(yàn)輔料進(jìn)行質(zhì)檢。PCR實(shí)驗(yàn)室的輔料指的是PCR實(shí)驗(yàn)中常用的一些輔助試劑和耗材，比如采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等。

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輔料質(zhì)檢的基本原則

輔料的質(zhì)檢通常是在新一批的輔料到實(shí)驗(yàn)室后統(tǒng)一做一次或者定期（半年或1年）做，因此質(zhì)檢就包含了驗(yàn)貨和質(zhì)檢2個(gè)部分。由于輔料的質(zhì)檢沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一般由各實(shí)驗(yàn)室自行制定，可簡可繁，這里提出一些方法供大家參考和批評(píng)指正。

1.外包裝檢查：外包裝應(yīng)完整無損無污，標(biāo)識(shí)清楚，檢查品名、品牌，貨號(hào)，規(guī)格、生產(chǎn)日期，有效期、保存條件等信息。

2.內(nèi)包裝檢查：內(nèi)包裝物品應(yīng)與外包裝標(biāo)識(shí)一致，檢查是否有破損，泄漏，內(nèi)容物是否齊全，是否有相應(yīng)的使用說明書等。

3.性能質(zhì)檢：檢測試劑耗材是否與其性能一致，比如吸頭的準(zhǔn)確性和氣密性等

4.污染物質(zhì)檢：檢測試劑耗材是否被常規(guī)檢測項(xiàng)目的待檢物污染，這種污染可能是物品生產(chǎn)環(huán)節(jié)，也可能是運(yùn)輸或?qū)嶒?yàn)室的保存過程中被污染。

5.抑制物質(zhì)檢：檢測試劑耗材中是否存在PCR反應(yīng)的抑制物，比如核酸酶。

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輔料質(zhì)檢的前提條件

1.弱陽性質(zhì)控：需要準(zhǔn)備弱陽性質(zhì)控，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、第三方質(zhì)控或弱陽性樣品用于進(jìn)行性能質(zhì)控和抑制物質(zhì)控。

2.陰性質(zhì)控：需要準(zhǔn)備確定陰性的樣品或空白對(duì)照，用于進(jìn)行污染物的質(zhì)控。

3.重復(fù)次數(shù)n：中國人喜歡3(三顧茅廬),6（六六大順）,8（發(fā)發(fā)發(fā)）,9（九九歸一），很遺憾這些數(shù)和實(shí)驗(yàn)室都關(guān)系不太大。符合統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的最常用的兩個(gè)數(shù)字是5和20,5通常是能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的最少重復(fù)次數(shù)，20通常用于計(jì)算95%的置信區(qū)間。大家根據(jù)自己的需要選擇合適的重復(fù)次數(shù)。

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常見輔料的質(zhì)檢

輔料的質(zhì)檢應(yīng)結(jié)合實(shí)際工作中可能用到的場景，并非越苛刻越好，需要每個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)合自身情況來設(shè)計(jì)和調(diào)整文中提到的參數(shù)。

1.離心管：

（1）滲漏密閉性：將n個(gè)離心管加入半量墨汁，蓋好蓋子后放入水中，浸泡30min，沒有墨汁滲出為合格。

（2）離心密閉性：將n個(gè)離心管加入半量純水，放入離心機(jī)，10000 rpm，30min，管蓋未崩開未漏液為合格。

（3）熱密閉性：將n個(gè)離心管加入半量純水，蓋好蓋子稱重后放入金屬浴中，65℃或90℃（巴氏消毒），30min，再進(jìn)行稱重，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液，前后重量未變化為合格。。

（4）冷密閉性：將n個(gè)離心管加入半量純水，放入-20℃冰箱，24h，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液為合格。

（5）污染物質(zhì)檢：將n個(gè)離心管分別加入半量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min，吸取純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（6）抑制物質(zhì)檢：將n個(gè)離心管分別加入弱陽性質(zhì)控物,室溫靜置5min，然后進(jìn)行提取;RNA核酸，DNA核酸，室溫靜置5min，作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR擴(kuò)增未被抑制為合格。

2.PCR管：

（1）滲漏密閉性：將n個(gè)PCR管加入半量墨汁，蓋好蓋子后放入水中，浸泡30min，沒有墨汁滲出為合格。

（2）離心密閉性：將n個(gè)PCR管加入半量純水，放入離心機(jī)，1000 rpm，30min，管蓋未崩開未漏液為合格。

（3）熱密閉性：將n個(gè)PCR管加入半量純水，蓋好蓋子稱重后放入PCR儀，設(shè)置一個(gè)常用的PCR程序，程序運(yùn)行完畢后，再進(jìn)行稱重，PCR管未變形，管蓋未崩開未漏液，前后重量未變化為合格。。

（4）冷密閉性：將n個(gè)PCR管加入半量純水，放入-20℃冰箱，24h，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液為合格。

（5）污染物質(zhì)檢：將n個(gè)PCR管加入半量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min，作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（6）抑制物質(zhì)檢：將n個(gè)PCR管分別加入弱陽性質(zhì)控物,室溫靜置5min，然后進(jìn)行提取;RNA核酸，DNA核酸，室溫靜置5min，作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR擴(kuò)增未被抑制為合格。

（7）空白熒光通透性：對(duì)于qPCR,需要考察PCR管是否有非特異性熒光信號(hào)，將n個(gè)空PCR管，蓋好蓋子后放入PCR儀，設(shè)置一個(gè)常用的PCR程序，程序運(yùn)行完畢后，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（8）陽性熒光通透性：對(duì)于qPCR,還需要考察PCR管是否會(huì)抑制熒光的通透性，將n個(gè)含弱陽性樣品和擴(kuò)增試劑的PCR管，與確認(rèn)無熒光干擾的PCR管，蓋好蓋子后放入PCR儀一同擴(kuò)增，設(shè)置一個(gè)常用的PCR程序，程序運(yùn)行完畢后，qPCR擴(kuò)增未被抑制為合格。

3.濾芯吸頭：測試吸頭需使用經(jīng)校準(zhǔn)的移液器

（1）準(zhǔn)確性：將n個(gè)吸頭分別吸取定量的純水稱重，重量與體積的關(guān)系按照1 g/mL換算。

（2）氣密性：取n個(gè)吸頭，吸取最大量程的含有1％甘油的墨水，觀察有色液體不出現(xiàn)在濾塞之上，液面相同為合格。

（3）防氣溶膠性能：取n個(gè)吸頭，吸取陽性核酸，反復(fù)吹吸10次，換另一個(gè)新吸頭在陰性純水中反復(fù)吹吸10次，取陰性純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（4）污染物質(zhì)檢：取n個(gè)吸頭，吸取陰性純水反復(fù)吹吸10次，取陰性純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（5）抑制物質(zhì)檢：取n個(gè)吸頭，吸取弱陽性質(zhì)控物反復(fù)吹吸10次，然后進(jìn)行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反復(fù)吹吸10次，作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR擴(kuò)增未被抑制為合格。

4.采血管、采樣管、采樣拭子和一次性吸管等：主要考察污染物和抑制物

（1）污染物質(zhì)檢：將n個(gè)耗材加入一定量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min后靜置30min，吸取純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（2）抑制物質(zhì)檢：將n個(gè)耗材分別加入弱陽性質(zhì)控物,室溫靜置30min，然后吸取質(zhì)控物進(jìn)行提取;作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR擴(kuò)增未被抑制為合格。

5.無核酸酶水、PBS等緩沖液：

（1）PH值：測量各緩沖液的PH值。

（2）污染物質(zhì)檢：吸取緩沖液作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（3）抑制物質(zhì)檢：將緩沖液分別與RNA核酸和DNA核酸混合，然后吸取混合液作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR擴(kuò)增未被抑制為合格。

6.移液器和離心管架及離心機(jī)的內(nèi)外表面：這些常見物品的外表面容易被核酸和細(xì)菌污染，主要查看這兩個(gè)指標(biāo)。

（1）表面核酸污染：用沾濕的拭子擦拭上述物品的外表面，然后浸泡到純水中10min，吸取純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（2）移液器內(nèi)腔核酸污染：對(duì)于常用的移液器的內(nèi)部，可使用無濾芯的吸頭在陰性純水中吹吸10次后，吸取純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR無擴(kuò)增為合格。

（3）表明細(xì)菌污染：用沾濕的無菌拭子擦拭上述物品的外表面，劃瓊脂平板，每個(gè)平板的菌落數(shù)不應(yīng)超過一定數(shù)量（我也不確定多少合適，由于不要求無菌操作一定會(huì)有細(xì)菌，但是也不應(yīng)該太多）。

非瘟和新冠后全國一下子新增了很多核酸檢測實(shí)驗(yàn)室，早期大家關(guān)注的點(diǎn)都在設(shè)施和硬件上，但是一個(gè)檢測實(shí)驗(yàn)室開展大量檢測工作之后，檢測中最弱的環(huán)節(jié)決定檢測的質(zhì)量。我們也需要將精力放在檢測中的每個(gè)細(xì)節(jié)上。