引物設(shè)計(jì)：

引物（primer）：

是DNA復(fù)制的起始點(diǎn)提供3′-OH，由一小段單鏈DNA或RNA構(gòu)成。

DNA引物設(shè)計(jì)：

PCR引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，需要一對(duì)DNA引物，即正向引物（forwardprimer）和反向引物（reverseprimer）。正向引物是與DNA雙鏈中無(wú)義鏈結(jié)合的引物，而反向引物是與有義鏈結(jié)合的引物。

引物設(shè)計(jì)原則：

• 引物與模板互補(bǔ)
• 引物與引物間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)
• 盡量避免引物在模板的非目的位點(diǎn)結(jié)合

• DNA探針：即一段DNA片段。早期主要用于Southern印跡雜交，通過(guò)克隆基因、限制性內(nèi)切酶獲得特定片段制備DNA探針。也可通過(guò)PCR擴(kuò)增或人工合成獲得。
  
  
• RNA探針：指帶有標(biāo)記，能與組織內(nèi)相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。由于RNA是單鏈分子，它與靶序列的雜交反應(yīng)效率較高。目前RNA探針主要有3種類型：① 單鏈cDNA探針：它可通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得；② cRNA探針：是以cDNA為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄而獲得；③ 寡核苷酸探針：以核苷酸為原料，通過(guò)DNA合成儀人工合成。
  
• 肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有類多肽骨架的DNA類似物，PNA的主鏈骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸與核酸堿基通過(guò)亞甲基羰基連接而成的。PNA可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。
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• 肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有類多肽骨架的DNA類似物，PNA的主鏈骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸與核酸堿基通過(guò)亞甲基羰基連接而成的。PNA可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。
  

• 探針的設(shè)計(jì)對(duì)雜交檢測(cè)至關(guān)重要，它決定著檢測(cè)的特異性。探針與目標(biāo)核酸相互作用越強(qiáng)，探針檢測(cè)的特異性越高。
  
• 影響檢測(cè)特異性最重要的因素是探針的長(zhǎng)度。目前，根據(jù)探針寡核苷酸的長(zhǎng)度，可以分為兩類：
  長(zhǎng)探針：其長(zhǎng)度在500～5000 bp之間，靶序列上存在點(diǎn)突變或多態(tài)性也不影響其雜交檢測(cè)，因而特異性和敏感性都能得到保障。短探針：其長(zhǎng)度小于500bp，它對(duì)點(diǎn)突變或多態(tài)性的檢測(cè)比較敏感。

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如何提高信噪比，達(dá)到最佳目標(biāo)核酸識(shí)別和檢測(cè)效果，需要對(duì)雜交條件進(jìn)行優(yōu)化。