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【CMDE】幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）審評(píng)報(bào)告公開

日期:2022-02-24

受理號(hào)：CSZ1900183

體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告

產(chǎn)品中文名稱：幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）

產(chǎn)品管理類別：第三類

申請(qǐng)人名稱：江蘇默樂生物科技股份有限公司

國家藥品監(jiān)督管理局

醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心

基本信息

一、申請(qǐng)人名稱

江蘇默樂生物科技股份有限公司

二、申請(qǐng)人住所

江蘇省泰州市健康大道 805 號(hào) G116 幢 6F-7F 東

三、生產(chǎn)地址

泰州市藥城大道 G02 廠房，R19 樓；江蘇省泰州市健康大道 805 號(hào) G116 幢 6F、7F 東

技術(shù)審評(píng)概述

一、產(chǎn)品概述

（一）產(chǎn)品主要組成成分

檢測(cè)緩沖液、引物探針、混合酶液、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。（具體詳見說明書）

（二）產(chǎn)品預(yù)期用途

用于檢測(cè)人胃黏膜組織樣本中幽門螺桿菌 23S rRNA 基因A2143G、A2143C 和 A2144G 突變和 gyrA 基因 261A、261G、260T、271A、271T、272G 突變。

本試劑盒用于幽門螺桿菌克拉霉素耐藥（23S rRNA 基因突變）和喹諾酮類抗生素耐藥（gyrA 基因突變）的臨床輔助診斷，為臨床醫(yī)生評(píng)估個(gè)體中幽門螺桿菌的耐藥性提供參考。試劑盒適用于幽門螺桿菌感染者且臨床認(rèn)為有必要采用胃粘膜組織進(jìn)行幽門螺桿菌耐藥診斷的患者。未與具體藥品進(jìn)行相關(guān)臨床試驗(yàn)，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為確診或排除的唯一依據(jù)。

（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格

50 測(cè)試/盒

（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)對(duì)人胃黏膜組織樣本中的幽門螺桿菌及耐藥突變的鑒別檢測(cè)。針對(duì)幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因（23S rRNA基因）與喹諾酮類抗生素耐藥基因（gyrA基因）的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物探針，采用FAM熒光標(biāo)記克拉霉素耐藥基因突變，采用HEX熒光標(biāo)記喹諾酮類抗生素耐藥基因突變。包含與克拉霉素耐藥相關(guān)的23SrRNA基因的3種突變和與喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)的gyrA基因的6種突變

二、臨床前研究概述

（一）主要原材料

本產(chǎn)品的主要原材料包括：引物、探針、HS Taq DNA 聚合酶、UNG 酶、dNTPs、質(zhì)粒等，這些原材料均通過外購的方式獲得。引物和探針均由申請(qǐng)人自行設(shè)計(jì)后，由專業(yè)的合成公司合成。申請(qǐng)人對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

企業(yè)參考品設(shè)置情況：申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測(cè)限參考品、精密度參考品以及突變檢測(cè)限參考品。企業(yè)參考品的主要原料為幽門螺桿菌菌液、臨床樣本核酸、質(zhì)粒等。參考品組成如下：

Hp 陽性參考品 10 份；Hp 陰性參考品 10 份；包含所有位點(diǎn)的最低檢測(cè)限參考品 30 份；Hp 精密度參考品 1 份；突變檢測(cè)限參考品 18 份。以上企業(yè)參考品均含有一定濃度的人類基因組DNA 作為內(nèi)標(biāo)。

企業(yè)參考品所采用臨床樣本采用基因測(cè)序的方法進(jìn)行確認(rèn)。企業(yè)參考品用于產(chǎn)品特異性、靈敏度、最低檢測(cè)限、精密度及突變檢測(cè)限檢測(cè)。

（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

申請(qǐng)人根據(jù)試劑盒中試劑及成分的主要生產(chǎn)工藝研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。試劑盒反應(yīng)體系的研究中，包含了臨床樣本的核酸提取與 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)等。其中核酸提取研究包括核酸純度、核酸完整性、重復(fù)性以及取樣部位、取樣大小等。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系研究包括引物探針濃度、dNTPs 濃度、DNA 聚合酶濃度、鎂離子濃度、BSA 濃度、丙三醇濃度以及PCR反應(yīng)程序優(yōu)化等。通過一系列功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。

（三）分析性能評(píng)估

該產(chǎn)品分析性能包括靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性（交叉反應(yīng)、干擾物質(zhì)）、精密度等。此外，還研究了配套使用的核酸提取試劑的性能。申請(qǐng)人提交了有效運(yùn)行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品在適用機(jī)型 ABI7500 熒光 PCR 儀與上海宏石SLAN-96P 上進(jìn)行的性能評(píng)估資料。

在靈敏度的性能評(píng)估中，進(jìn)行了最低檢測(cè)限與突變率檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證。

最低檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證：申請(qǐng)人采用臨床樣本培養(yǎng)物對(duì)每個(gè)突變位點(diǎn)分別建立檢出限。選取分別具有 23S rRNA 基因2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G 突變的菌液，每種突變菌株分別稀釋至不同濃度，使用 3 批試劑對(duì)每一濃度重復(fù)檢測(cè) 20 次，以此確定試劑盒的最低檢出限，結(jié)果顯示：具有 95%以上陽性檢出率的樣本濃度均不高于 1×104copies/mL。申請(qǐng)人進(jìn)一步選取 10 例具有不同突變類型的臨床培養(yǎng)物，并使用幽門螺桿菌陰性樣本稀釋至1×104copies/mL，在稀釋物中添加不同干擾物質(zhì)后再檢測(cè)，結(jié)果顯示，在存在干擾物質(zhì)的情況下，試劑盒的最低檢出限仍然為1×104copies/mL。

突變檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證：申請(qǐng)人將不同濃度、具有不同突變類型的核酸與野生核酸按照不同比例進(jìn)行混合。核酸濃度為 1pg/μL 時(shí)，設(shè)置突變比例分別為 10%、0.1%和 0.001%，濃度為 0.001pg/μL 時(shí)，設(shè)置突變比例為 80%、50%和 10%。每種混合核酸均進(jìn)行 20 次重復(fù)，結(jié)果顯示，當(dāng)野生型幽門螺桿菌濃度為 1pg/μL，各突變位點(diǎn)具有 90%以上陽性檢出率的最低突變比例為 0.1%；當(dāng)野生幽門螺桿菌濃度為 0.001pg/μL，各突變位點(diǎn)具有 90%以上陽性檢出率的最低占比為 50%。申請(qǐng)人進(jìn)一步將經(jīng)測(cè)序方法驗(yàn)證過的、具有不同突變類型的核酸與野生型核酸混合按照一定比例混合后進(jìn)行檢測(cè)，用以驗(yàn)證突變檢測(cè)限。

結(jié)果顯示：當(dāng)野生型幽門螺桿菌濃度為 1pg/μL，0.1%突變比例條件下，各突變位點(diǎn)均能 100%檢出；當(dāng)野生幽門螺桿菌濃度為0.001pg/μL，50%突變比例條件下，各突變位點(diǎn)均能 100%檢出。在準(zhǔn)確度的性能評(píng)估中，使用 3 批試劑對(duì)企業(yè)陽性參考品和陰性參考品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，陽性符合率和陰性符合率均為 100%。

在交叉反應(yīng)的性能評(píng)估中，使用 3 批試劑檢測(cè)胃腸道常見的其他病原微生物，如蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯桿菌肺炎、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、類志賀鄰單胞菌、流感嗜血桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎奈瑟菌、結(jié)核分枝桿菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌、變形桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌等，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

在干擾物質(zhì)的性能評(píng)估中，采用向弱陽性樣本中加入干擾物質(zhì)的方法進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常見干擾物質(zhì)如血紅蛋白（1000.0 mg/L）、粘蛋白（2000.0 mg/L）、白細(xì)胞（109個(gè)/L）、阿莫西林（0.75mg/L）、克拉霉素（0.29mg/L）、左氧氟沙星（1.62mg/L）、四環(huán)素（5.0mg/L）、甲硝唑（40.0mg/L）、奧美拉唑（0.4mg/L）、雷貝拉唑（0.802mg/L）、蘭索拉唑（1.15mg/L）、泮托拉唑（3.81mg/L）、枸櫞酸鉍鉀（67.85mg/L）、阿司匹林（ 300.0mg/L ）、對(duì) 乙酰氨基酚（ 13.824mg/L ）、鋁碳酸鎂（1500.0mg/L）、乳酸菌素（3600.0mg/L）和胃康靈（100.0mg/L）等在上述濃度時(shí)對(duì)本試劑的檢測(cè)結(jié)果沒有影響。

在精密度的性能評(píng)估中，選擇 10 例具有不同突變類型的樣本，并稀釋至不同濃度，在 20 天內(nèi)，每天由 2 人分別進(jìn)行 2個(gè)輪次的檢測(cè)，每一次檢測(cè)做 3 個(gè)重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果顯示：批內(nèi)、批間、日內(nèi)、日間、儀器間以及操作者間的變異系數(shù) CV 均小于 5%。

本次申報(bào)產(chǎn)品包括 1 種包裝規(guī)格（50 測(cè)試/盒），2 種實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀適用機(jī)型（ABI7500 與上海宏石 SLAN-96P），申請(qǐng)人提供了三批產(chǎn)品在適用機(jī)型上的性能評(píng)估資料。

（四）陽性判斷值研究

申請(qǐng)人選取胃粘膜組織臨床樣本，包含 23S rRNA 基因2143C/2143G/2144G 和 gyrA 基因 261G/261A/260T/271A/271T/272G 不同突變的樣本，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行 ROC 曲線分析，結(jié)果顯示：幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因突變檢測(cè) FAM 熒光 Ct 值的參考值為 35.04；幽門螺桿菌喹諾酮類抗生素耐藥基因突變HEX 熒光 Ct 值的參考值為 35.73。本試劑盒使用人源基因作為試劑盒內(nèi)標(biāo)，確定內(nèi)標(biāo) CY5 熒光 Ct 值的參考值為 32.00。同時(shí)，將本試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步與臨床培養(yǎng)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較，驗(yàn)證了試劑陽性判斷值的合理性。

（五）穩(wěn)定性研究

申請(qǐng)人對(duì)本產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、胃黏膜組織樣本的穩(wěn)定性以及核酸的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時(shí)間。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性的研究：采用三批試劑進(jìn)行研究，將本試劑盒避光密閉保存在-20±5℃條件下，分別在第 0、1、2、3、6、9、12、13 月取出檢測(cè)，檢測(cè)的樣本類型包括陽性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、精密度參考品等企業(yè)參考品，以從準(zhǔn)確度、特異性、檢測(cè)限、精密度等方面綜合驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定程度。檢測(cè)結(jié)果表明，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，確定產(chǎn)品在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下，可穩(wěn)定保存 12 個(gè)月。

此外，申請(qǐng)人對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、樣本及核酸穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說明書的聲稱。

三、臨床評(píng)價(jià)概述

申請(qǐng)人在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、湖州市中心醫(yī)院、山西省人民醫(yī)院和四川大學(xué)華西醫(yī)院共 5 家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)完成了臨床試驗(yàn)。

臨床試驗(yàn)主要包括兩部分內(nèi)容：第一部分，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類抗生素體外藥敏實(shí)驗(yàn)（E-test）進(jìn)行比較研究，共計(jì)入組 801 例幽門螺桿菌感染受試者樣本（幽門螺桿菌培養(yǎng)陽性），其中藥敏實(shí)驗(yàn)檢出克拉霉素耐藥菌株 562 例，克拉霉素敏感菌株 239 例，研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)用體外診斷試劑臨床靈敏度是 91.81%（95%CI: 89.25%～93.81%），臨床特異度是 80.33%（95%CI：74.83%～84.88%）。藥敏實(shí)驗(yàn)檢出喹諾酮類抗生素耐藥菌株 532 例，喹諾酮類抗生素敏感菌株 269 例，試驗(yàn)用體外診斷試劑臨床靈敏度是 84.96%（95%CI：81.67%～87.75%），臨床特異度是 82.16%（95%CI：77.14%～86.27%）。試驗(yàn)還對(duì)所有突變位點(diǎn)進(jìn)行了單獨(dú)統(tǒng)計(jì)，各位點(diǎn)與藥敏結(jié)果符合率良好，且滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

第二部分，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與 Sanger 測(cè)序法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。共計(jì)入組樣本 1786 例，其中，測(cè)序檢出 23S rRNA基因的 3 種常見突變陽性 813 例，突變陰性 973 例，兩種方法的陽性符合率為 94.10%（95%CI：92.26%～95.52%），陰性符合率為 96.71%（95%CI：95.39%～97.66%），總符合率為 95.52%（95%CI：94.46%～96.39%）；測(cè)序檢出 gyrA 基因的 6 種常見突變陽性 675 例，突變陰性 1111 例，兩種方法的陽性符合率為93.48%（95%CI：91.36%～95.11%)，陰性符合率為 94.42%（95%CI：92.91%～95.62%），總符合率為 94.06%（95%CI：92.87%～95.07%）?？己嗽噭┡c Sanger 測(cè)序法一致性良好。

綜上，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，本產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果用于幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類抗生素耐藥的輔助診斷，靈敏度、特異度良好，基本滿足臨床需求。

四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定

（一）受益評(píng)估

目前認(rèn)為幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起慢性活動(dòng)性胃炎、十二指腸及胃潰瘍的主要原因。另外，根據(jù)目前多方面流行病學(xué)調(diào)查顯示，發(fā)現(xiàn) Hp 除了與上消化道的慢性炎癥、消化道潰瘍、胃癌等疾病高度相關(guān)以外，同時(shí)與許多胃腸外疾病的發(fā)生、發(fā)展有相當(dāng)密切的關(guān)系。

目前對(duì)幽門螺桿菌的治療主要采用含有抗生素的三聯(lián)或四聯(lián)療法進(jìn)行，而隨著抗生素的大量使用，幽門螺桿菌已經(jīng)出現(xiàn)了抗生素的耐藥現(xiàn)象，克拉霉素與喹諾酮類抗生素耐藥率在20%-50%之間?！兜谖宕稳珖拈T螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》中指出：不論初次治療或補(bǔ)救治療，如需選擇含克拉霉素、甲硝唑或左氧氟沙星的三聯(lián)方案，應(yīng)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。有研究表明，基于藥敏試驗(yàn)的多重療法相比于經(jīng)驗(yàn)性的用藥，Hp 的根除率從 63%提高至 86%，但培養(yǎng)有一定技術(shù)要求，敏感性偏低，因此不推薦單純用于 Hp 感染的常規(guī)診斷。我國《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》指出：分子生物學(xué)可用于 Hp 耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)，并明確認(rèn)為該方法學(xué)對(duì) Hp 耐藥基因突變的檢測(cè)具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

本試劑檢測(cè)幽門螺桿菌感染患者胃粘膜組織樣本中的幽門螺桿菌 23S rRNA 基因兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的三種常見突變 2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 6 種常見突變 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G。用于幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類抗生素耐藥的臨床輔助診斷，為臨床醫(yī)生評(píng)估個(gè)體中幽門螺桿菌的耐藥特性提供參考。臨床應(yīng)用的主要受益在于：對(duì)于幽門螺桿菌感染者需要進(jìn)行克拉霉素和喹諾酮類抗生素藥物敏感性評(píng)價(jià)的，提供除細(xì)菌藥敏試驗(yàn)外的一種分子生物學(xué)方法的選擇。特別是可以彌補(bǔ)幽門螺桿菌培養(yǎng)敏感性不足的問題。幽門螺桿菌陽性可以及時(shí)治療，耐藥陽性患者可以避免使用克拉霉素或喹諾酮類抗生素治療導(dǎo)致的失敗，從而提高幽門螺桿菌的根除率。經(jīng)臨床評(píng)價(jià)，該產(chǎn)品對(duì)克拉霉素耐藥幽門螺桿菌菌株感染患者的檢出靈敏度是 94.10%，對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥幽門螺桿菌菌株感染患者的檢出靈敏度是 93.48%。

（二）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

該產(chǎn)品主要的風(fēng)險(xiǎn)來自于檢測(cè)存在假陰性情況，如對(duì)克拉霉素耐藥幽門螺桿菌菌株感染患者檢測(cè)結(jié)果為陰性，則可能導(dǎo)致患者使用克拉霉素進(jìn)行治療，進(jìn)一步導(dǎo)致治療失敗，經(jīng)臨床研究，本檢測(cè)假陰性的概率是 5.90%。如對(duì)喹諾酮類抗生素幽門螺桿菌菌株感染患者檢測(cè)結(jié)果為陰性，則可能導(dǎo)致患者使用喹諾酮類抗生素進(jìn)行治療，進(jìn)一步導(dǎo)致治療失敗，經(jīng)臨床研究，本檢測(cè)假陰性的概率是 6.52%。

（三）風(fēng)險(xiǎn)收益評(píng)價(jià)結(jié)論

根據(jù)申請(qǐng)人提供的申報(bào)資料，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，在目前認(rèn)知水平上，認(rèn)為該產(chǎn)品能夠較大程度地滿足醫(yī)療需求，預(yù)期為適用人群帶來的受益大于風(fēng)險(xiǎn)。但為保證用械安全，基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的規(guī)避，需在說明書中提示以下信息：采用本試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)得到的結(jié)果僅供臨床參考，不作為治療或其它臨床管理的唯一依據(jù)。

綜合評(píng)價(jià)意見

本申報(bào)項(xiàng)目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)，屬于境內(nèi)同品種首個(gè)產(chǎn)品。申請(qǐng)人的注冊(cè)申報(bào)資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國務(wù)院令第 680 號(hào)）、《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令 2014 年第 5 號(hào)）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后，建議準(zhǔn)予注冊(cè)。

2022 年 1 月 24 日

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