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【CMDE】α 和 β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法)審評(píng)報(bào)告公開(kāi)

日期:2022-04-21

受理號(hào):CSZ2200011

體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告

產(chǎn)品中文名稱:α 和 β 地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒 (聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法)?

產(chǎn)品管理類(lèi)別:第三類(lèi)?

申請(qǐng)人名 稱:華大生物科技(武漢)有限公司?

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局?

醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心

基本信息

一、申請(qǐng)人名稱 華大生物科技(武漢)有限公司?
二、申請(qǐng)人住所 武漢市東湖新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)高新大道 666 號(hào)武漢國(guó)家生物 產(chǎn)業(yè)基地項(xiàng)目 B、C、D 區(qū)研發(fā)樓 B2 棟?
三、生產(chǎn)地址 武漢市東湖新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)高新大道 666 號(hào)武漢國(guó)家生物產(chǎn) 業(yè)基地項(xiàng)目 B、C、D 區(qū)研發(fā)樓 B2 棟五樓、B1 棟一樓

技術(shù)審評(píng)概述

一、產(chǎn)品概述?

(一)產(chǎn)品主要組成成分?

表 1 主要組成成分



(二)產(chǎn)品預(yù)期用途?

本試劑盒用于文庫(kù)構(gòu)建,采用高通量測(cè)序技術(shù)(聯(lián)合探 針錨定聚合測(cè)序法)定性檢測(cè)人外周血樣本中基因組 DNA的 4 種 α-地貧缺失型、2 種 β-地貧缺失型、3 種 α-地貧非缺失 型和 16 種 β-地貧非缺失型。用于 α 和/或 β 地貧的輔助診斷(遺傳診斷)。本試劑盒檢測(cè)結(jié)果不作為地中海貧血臨床診 斷的唯一依據(jù),僅供臨床參考。?

表 2 試劑盒檢測(cè)的地中海貧血基因變異信息

(三)產(chǎn)品包裝規(guī)格?

1152 人份/盒?

(四)產(chǎn)品檢驗(yàn)原理?

根據(jù) α-地貧和 β-地貧發(fā)生相關(guān)的 HBA1、HBA2 和 HBB 三個(gè)基因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)一系列引物,以實(shí)現(xiàn)基因的有效擴(kuò)增。利用多重 PCR 技術(shù)將樣本中的 HBA1、HBA2 和 HBB 基因 擴(kuò)增富集并同時(shí)引入用于樣本識(shí)別的標(biāo)簽序列。將多例(≤96 例)樣本的 PCR 產(chǎn)物按一定比例混合成一個(gè)文庫(kù),經(jīng)過(guò) 一系列的文庫(kù)制備過(guò)程,每個(gè)文庫(kù)中的樣本 DNA 序列都加 上了用于測(cè)序及文庫(kù)識(shí)別的接頭序列。將制備好的文庫(kù)等質(zhì) 量比例上機(jī)測(cè)序,使用基因測(cè)序儀通過(guò)聯(lián)合探針錨定聚合測(cè) 序技術(shù)對(duì)各文庫(kù)中的樣本 DNA 進(jìn)行序列信息讀取。每一條 DNA 的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)文庫(kù)接頭序列、樣本標(biāo)簽序列和引物序 列比對(duì)拆分后將被精確定位到每一個(gè)樣本的每一個(gè)擴(kuò)增區(qū) 域中。

將每個(gè)樣本的目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序結(jié)果與以 GRCh37 基因 組序列為參考構(gòu)建的目標(biāo)參考序列進(jìn)行比對(duì)分析,再通過(guò)變 異檢測(cè)、陽(yáng)性判斷值以及來(lái)自于 HbVar(2017 年 10 月版) 和 Ithanet 數(shù)據(jù)庫(kù)(2017 年 10 月版)的變異坐標(biāo)信息與變異 名稱信息,判斷樣本中是否存在地貧基因變異以及何種變異。

?二、臨床前研究概述?

(一)主要原材料?
1.主要原材料的選擇?
試劑盒主要原材料包括:PCR 標(biāo)簽引物、PCR 反應(yīng)液、 PCR 反應(yīng)熱啟動(dòng)酶、測(cè)序接頭、末端修復(fù)緩沖液、T4 多聚 核苷酸磷酸激酶、T4 DNA 聚合酶 (rTaq 聚合酶)、Klenow Fragment、加“A”酶、連接酶、磁珠、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照 品等。主要原材料均為外購(gòu)方式獲得。PCR 標(biāo)簽引物和測(cè)序 接頭為申請(qǐng)人自行設(shè)計(jì)后由專(zhuān)業(yè)的合成公司合成。
申請(qǐng)人選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供原料,通過(guò)功能性試驗(yàn)篩選出最佳原 材料和供應(yīng)商,制定了各主要原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。?
2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況
企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、重復(fù)性參考 品、精密度參考品、檢測(cè)限參考品。陽(yáng)性參考品 37 份,由外 周血樣本和細(xì)胞系樣本組成,樣本涵蓋該產(chǎn)品可檢出的所有 變異類(lèi)型的雜合型;陰性參考品 14 份,由外周血樣本和細(xì)胞 系樣本組成,包含無(wú)變異樣本、產(chǎn)品檢測(cè)范圍外的地貧變異 類(lèi)型樣本及同源序列變異樣本;重復(fù)性參考品 5 份,均為細(xì) 胞系樣本,涵蓋產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類(lèi)型和 1 份無(wú) 變異的陰性樣本;精密度參考品 5 份,為包含弱陽(yáng)性濃度水 平在內(nèi)不同濃度水平和無(wú)變異的外周血樣本;檢測(cè)限參考品 4 份,均為細(xì)胞系樣本,每份檢測(cè)限參考品做高、中、低 3 個(gè) 水平的梯度稀釋?zhuān)w該產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類(lèi)型;檢測(cè)限參考品 37 份,由細(xì)胞系樣本和外周血樣本組成,包含 產(chǎn)品可檢出的所有變異類(lèi)型的最低檢出限水平。?
試劑盒包含 4 份陽(yáng)性對(duì)照品和 1 份陰性對(duì)照品,用于檢 測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制。陰陽(yáng)性對(duì)照品均為細(xì)胞系樣本,陽(yáng)性對(duì) 照品涵蓋該產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類(lèi)型,陰性對(duì)照品 為無(wú)變異樣本。?
(二)生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
申請(qǐng)人通過(guò)對(duì)多重 PCR 反應(yīng)引物配比、PCR 反應(yīng)標(biāo)簽 引物用量、PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件、PCR 產(chǎn)物混合比例、 陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)方式、文庫(kù)制備起始量、純化磁珠用量、打斷 參數(shù)、末端修復(fù)反應(yīng)體系、末端修復(fù)反應(yīng)時(shí)間、加 A 反應(yīng)體 系、連接反應(yīng)體系、篩選磁珠用量、樣本有效序列數(shù)、上機(jī) 文庫(kù)數(shù)等條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化,通過(guò)功能性試驗(yàn),最終確定 了最佳的生產(chǎn)工藝與反應(yīng)體系。?
(三)分析性能評(píng)估?
分析性能評(píng)估包括核酸提取試劑性能研究、準(zhǔn)確度、重 復(fù)性、精密度、分析特異性、分析靈敏度等性能評(píng)估。針對(duì)核酸提取試劑性能研究,申請(qǐng)人采用臨床樣本平行 比較了核酸純化試劑和核酸提取試劑的提取性能,通過(guò)對(duì)比 提取所得 DNA 的濃度和純度,確定核酸提取試劑為該產(chǎn)品 的配套提取試劑。?
準(zhǔn)確度評(píng)估中,申請(qǐng)人分別在兩種適配機(jī)型(基因測(cè)序 儀(MGISEQ-2000)和基因測(cè)序儀(MGISEQ-200))上使用 三批試劑盒對(duì)企業(yè)參考品盤(pán)中的 37 份陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè), 陽(yáng)性符合率為 100%。另外,申請(qǐng)人分別在兩種適配機(jī)型(基 因測(cè)序儀(MGISEQ-2000)和基因測(cè)序儀(MGISEQ-200)) 上使用一批試劑盒對(duì)已知臨床檢測(cè)結(jié)果的臨床樣本進(jìn)行檢 測(cè),試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)各變異類(lèi)型的陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率均為 100%。精密度評(píng)估中,申請(qǐng)人使用三批試劑盒對(duì)臨界濃度 10 ng/μL 和中高濃度 15 ng/μL 的 5 份外周血樣本和 1 份細(xì)胞系 樣本在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室由兩組操作者在不同適配機(jī)型(基因測(cè)序 儀(MGISEQ-2000)和基因測(cè)序儀(MGISEQ-200))的不同 儀器上進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度的每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè) 3 次,連續(xù) 檢測(cè) 20 天。檢測(cè)結(jié)果均與已知結(jié)果一致。分析特異性評(píng)估中,申請(qǐng)人分別在兩種適配機(jī)型(基因 測(cè)序儀(MGISEQ-2000)和基因測(cè)序儀(MGISEQ-200))上使用三批試劑盒對(duì)企業(yè)參考品盤(pán)中的 14 份陰性參考品進(jìn)行 檢測(cè),陰性符合率為 100%;對(duì) Hb Q-Thailand、Hb New York、 Hb J-Bangkok 等具有同源性序列的血紅蛋白異常樣本和-- FIL、-α21.9、Hb Lepore-Boston-Washington 等檢測(cè)范圍外的 地貧變異陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均為未檢出檢測(cè)范圍 內(nèi)的基因變異;對(duì)梯度稀釋的血紅素、甘油三酯、膽紅素、 肝素鈉、EDTA?K2、甲磺酸去鐵胺、地拉羅司分散片、葉酸 片和愛(ài)樂(lè)維(復(fù)合維生素片)、布洛芬、鹽酸氨溴索、蒲地藍(lán) 消炎膠囊、頭孢克肟干擾樣本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明,當(dāng) DNA 樣本中血紅素濃度≤200g/L、甘油三酯濃度≤1000 mg/dL、膽紅素濃度≤2 mg/dL、EDTA?K2 濃度≤2.5 mg/mL、 甲磺酸去鐵胺濃度≤1.6 mg/mL、地拉羅司濃度≤1.6 mg/mL、葉酸濃度≤0.38 mg/L、愛(ài)樂(lè)維(復(fù)合維生素)平均濃度 ≤35.6 mg/L、布洛芬濃度≤0.143mg/mL、鹽酸氨溴索濃度≤ 0.12mg/mL、頭孢克肟濃度≤0.286mg/mL、蒲地藍(lán)消炎膠囊 濃度≤2.86mg/mL 時(shí),干擾物質(zhì)對(duì)試劑盒檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響,試劑盒具有較好的抗干擾能力。當(dāng)樣本中的肝素鈉濃度 在 2IU/mL 以上時(shí),試劑盒檢測(cè)失敗率高,試劑盒不適用于 檢測(cè)肝素鈉抗凝采血管采集的樣本,樣本采集應(yīng)選用 EDTA?K2 抗凝采血管。最低檢測(cè)限研究中,申請(qǐng)人分別在兩種適配機(jī)型(基因 測(cè)序儀(MGISEQ-2000)和基因測(cè)序儀(MGISEQ-200))上 進(jìn)行了研究。
首先選擇產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類(lèi)型的 細(xì)胞系樣本進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)總€(gè)濃度梯度樣本重復(fù)檢測(cè) 3 次, 將具有 100%檢出率的最低濃度設(shè)定為預(yù)估最低檢測(cè)限。之 后,將包含所有申報(bào)位點(diǎn)的雜合型樣本稀釋至預(yù)估最低檢測(cè) 限濃度,每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè) 20 次,將檢測(cè)結(jié)果為相應(yīng)的基因 型別且每個(gè)型別的檢出率均≥95%時(shí)濃度,設(shè)定為最低檢測(cè) 限濃度。最后,申請(qǐng)人使用三批試劑盒對(duì)各個(gè)申報(bào)位點(diǎn)的雜 合型樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè) 20 次,驗(yàn)證了最低檢測(cè)限。(四)陽(yáng)性判斷值?
申請(qǐng)人使用該產(chǎn)品對(duì) 329 例已有地貧基因檢測(cè)結(jié)果的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),對(duì)非缺失型的陽(yáng)性樣本進(jìn)行突變頻率的統(tǒng)計(jì)分析,基于理論雜合突變頻率和純合突變頻率,利用 Tukey’s 檢驗(yàn)確定非缺失型的陽(yáng)性判斷值;對(duì)缺失型陽(yáng)性樣本 和陰性樣本進(jìn)行歸一化序列的統(tǒng)計(jì)分析,利用 k-medians 聚 類(lèi)算法確定缺失型的陽(yáng)性判斷值。?
申請(qǐng)人使用該產(chǎn)品對(duì) 428 例已有地貧基因檢測(cè)結(jié)果的臨 床樣本進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證。結(jié)果顯示陽(yáng)性符合率、陰性 符合率和總符合率均為 100%,Kappa 系數(shù)均為 1。建立的陽(yáng) 性判斷值能準(zhǔn)確判斷檢測(cè)范圍內(nèi)的 25 種地貧變異類(lèi)型的陰、 陽(yáng)性。?
(五)穩(wěn)定性研究?
為考核該產(chǎn)品在不同條件下性能的穩(wěn)定性狀況,為試劑 盒的包裝、運(yùn)輸、使用和保存條件的確定和有效期的建立提 供依據(jù),申請(qǐng)人進(jìn)行了穩(wěn)定性研究,包括效期穩(wěn)定性、凍融 穩(wěn)定性等。研究結(jié)果表明:包裝盒 1 與包裝盒 2 置于-18℃以 下保存,包裝盒 3 置于 2℃~8℃保存,有效期為 12 個(gè)月;包裝盒 1、包裝盒 2 凍融 6 次仍可有效檢測(cè);試劑盒每天開(kāi) 瓶 1 次連續(xù)開(kāi)瓶 7 天、每 2 天開(kāi)瓶 1 次連續(xù) 2 周、每周開(kāi)瓶 1 次連續(xù) 4 周、每月開(kāi)瓶 1 次 4 個(gè)月內(nèi)開(kāi)瓶小于 4 次仍可有 效檢測(cè)。?
適用樣本穩(wěn)定性研究:為考察該產(chǎn)品對(duì)不同條件下儲(chǔ)存 不同時(shí)間的樣本的檢出性能,申請(qǐng)人使用該產(chǎn)品分別對(duì)短期儲(chǔ)存、長(zhǎng)期儲(chǔ)存的樣本進(jìn)行測(cè)試,最終確定外周血樣本在室 溫下儲(chǔ)存 9 天、在 2℃~8℃儲(chǔ)存 14 天、在-18℃以下儲(chǔ)存 9 個(gè)月仍可有效檢測(cè);樣本反復(fù)凍融次數(shù)應(yīng)不超過(guò) 6 次;樣本 在 2℃~8℃運(yùn)輸時(shí),運(yùn)輸時(shí)間不超過(guò) 8 天。?

三、臨床評(píng)價(jià)概述?

申請(qǐng)人在郴州市第一人民醫(yī)院、珠海市婦幼保健院、云 南省第一人民醫(yī)院共三家臨床機(jī)構(gòu)完成了臨床試驗(yàn)。針對(duì)已 有同類(lèi)產(chǎn)品產(chǎn)品上市的基因型,采用試驗(yàn)體外診斷試劑與已 上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行比較研究;針對(duì)尚無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的基因 型,采用試驗(yàn)體外診斷試劑與 Sanger 測(cè)序法進(jìn)行比較研究。?
臨床試驗(yàn)的樣本類(lèi)型為外周血。入組病例包括具有地貧癥狀 和/或體征的疑似地貧患者、血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素的疑 似地貧患者、臨床考慮為地貧攜帶者、需與地貧進(jìn)行鑒別診 斷的其他疾病患者等。對(duì)于尚無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的基因型,提 交了支持該基因型臨床意義的臨床試驗(yàn)資料及相關(guān)文獻(xiàn)。臨床試驗(yàn)共入組受試者 1108 例。有效樣本中陽(yáng)性樣本 1034 例。各基因型別的陽(yáng)性樣本情況如下:α-地貧缺失型 434 例,β-地貧缺失型 7 例,α-地貧非缺失型 252 例,β-地貧非缺 失型 723 例。?
臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,該產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的 25 個(gè)基因型 別的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)比試劑/Sanger 測(cè)序法相比的陽(yáng)性符合率均為 100%、陰性符合率均為 100%、總符合率均為 100%。綜上所述,該產(chǎn)品臨床試驗(yàn)試劑符合《體外診斷試劑臨 床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注 冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該產(chǎn) 品與已上市同類(lèi)產(chǎn)品一致性較好。?

四、產(chǎn)品收益風(fēng)險(xiǎn)判定?

根據(jù)申請(qǐng)人提供的申報(bào)資料,經(jīng)綜合評(píng)價(jià),在目前認(rèn)知 水平上,認(rèn)為該產(chǎn)品的上市為適用人群帶來(lái)的受益大于風(fēng)險(xiǎn)。但為保證用械安全,基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的規(guī)避,需要在說(shuō) 明書(shū)中提示以下信息:1.本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考,不能作為診斷的 唯一依據(jù)。對(duì)患者的臨床診斷應(yīng)結(jié)合臨床癥狀/體征、病史、 其他實(shí)驗(yàn)室檢查等情況綜合考慮;2.本試劑盒適用于人的外周血樣本檢測(cè),不適用于其它 樣本檢測(cè);3.本試劑盒可以對(duì) 4 種缺失型 α-地中海貧血、2 種缺失 型 β-地中海貧血、3 種非缺失型 α-地中海貧血和 16 種非缺 失型 β-地中海貧血進(jìn)行檢測(cè),但仍有檢測(cè)范圍之外的變異, 可能造成漏檢,這類(lèi)樣本可用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。4.不合理的樣本采集、運(yùn)送、處理、核酸過(guò)度降解以及未經(jīng) 驗(yàn)證的其他干擾或 PCR 抑制因子等均有可能會(huì)導(dǎo)致假陰性 或假陽(yáng)性結(jié)果。

綜合評(píng)價(jià)意見(jiàn)?

本申報(bào)項(xiàng)目為境內(nèi)第三類(lèi)醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè),申請(qǐng)人的 注冊(cè)申報(bào)資料符合現(xiàn)行要求,依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》 (國(guó)務(wù)院令第 739 號(hào))、《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》 (國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第 48 號(hào))等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī) 與配套規(guī)章,經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后,建議準(zhǔn)予注冊(cè)。?

2022 年 3 月 31 日
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