結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┳?cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告公開(kāi)

日期:2021-12-24

體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告

產(chǎn)品中文名稱(chēng)：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?/span>

產(chǎn)品管理類(lèi)別：第三類(lèi)

申請(qǐng)人名稱(chēng)：北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局

醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心

基本信息

一、申請(qǐng)人名稱(chēng)

北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司

二、申請(qǐng)人住所

北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)康定街1號(hào)14號(hào)樓3層1室

三、生產(chǎn)地址

北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)康定街1號(hào)14號(hào)樓2層、北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)康定街1號(hào)10號(hào)樓2層

技術(shù)審評(píng)概述

一、產(chǎn)品概述

（一）產(chǎn)品主要組成成分

本試劑盒含有TBPCR反應(yīng)液、TB引物探針混合液、TB陰性質(zhì)控品、TB陽(yáng)性質(zhì)控品、TB弱陽(yáng)性質(zhì)控品，主要組成成分見(jiàn)表1。

表1試劑盒主要組成成分

（二）產(chǎn)品預(yù)期用途

本試劑盒用于體外定性檢測(cè)人福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸。

本產(chǎn)品采用PCR熒光探針技術(shù)，用于輔助結(jié)核病的病理診斷。

結(jié)核分枝桿菌（tuberclebacilli，TB）復(fù)合群主要包括結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，除田鼠分枝桿菌外，其余三種均對(duì)人致病，是結(jié)核病的病原菌，可通過(guò)呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官的結(jié)核病，以肺結(jié)核最常見(jiàn)。其致病作用可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)頑強(qiáng)增殖引起炎癥反應(yīng)，以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性損傷有關(guān)。TB基因組中的插入序列IS6110具有特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的特點(diǎn)，是TB檢測(cè)常用的靶基因片段。

實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備相關(guān)的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。

該產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀、體征、流行病學(xué)背景及其他臨床診斷結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，不得作為疾病診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格

24人份/盒

（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

本產(chǎn)品檢測(cè)的靶基因?yàn)門(mén)B基因組中的插入序列IS6110，該序列作為靶基因具有特異性強(qiáng)，重復(fù)性好等特性。內(nèi)標(biāo)為Her2基因，在人基因組中表達(dá)穩(wěn)定，是常見(jiàn)的管家基因。本產(chǎn)品采用熒光PCR技術(shù)，選取結(jié)核分枝桿菌基因組中相對(duì)保守的區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及探針，在樣本提取之后采用熒光PCR對(duì)TBDNA進(jìn)行快速檢測(cè)。

本產(chǎn)品采用了Taqman熒光探針技術(shù)，其試劑比常規(guī)PCR試劑多了一個(gè)寡聚核苷酸探針，這個(gè)探針帶有一個(gè)熒光發(fā)光基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，完整的探針在特定光源激發(fā)下，發(fā)光基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光被淬滅基團(tuán)全部吸收，樣品無(wú)熒光。PCR過(guò)程中，Taq酶在延伸DNA鏈的同時(shí)，可通過(guò)自身的5’→3’核酸外切酶活性降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針，使熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，分離后的熒光報(bào)告基團(tuán)在特定光源激發(fā)下產(chǎn)生熒光。通過(guò)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程熒光信號(hào)的變化，對(duì)未知模板進(jìn)行定性分析。

同時(shí)本產(chǎn)品采用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系，用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系可能存在的抑制因素。內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品與靶基因無(wú)同源性，內(nèi)標(biāo)探針選擇的是與靶基因探針沒(méi)有沖突的另一檢測(cè)通道。

二、臨床前研究概述

（一）主要原材料

本試劑盒主要原材料包括：引物、探針、qPCRMasterMix、UDG酶、dUTP、TB菌液。其中引物、探針為申請(qǐng)人自行設(shè)計(jì)后由專(zhuān)業(yè)的合成公司合成，其他原材料均為外購(gòu)方式獲得。申請(qǐng)人選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供的原料，通過(guò)功能性試驗(yàn)，篩選出最佳原材料和供應(yīng)商，并制定了各主要原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

企業(yè)參考品設(shè)置情況：申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品，包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品。其中：

陽(yáng)性參考品共15份，包括肺結(jié)核樣本、右側(cè)頸結(jié)核樣本、淋巴結(jié)核樣本、非洲分枝桿菌樣本、骨結(jié)核樣本、左肩結(jié)核樣本、腎結(jié)核樣本、腰椎結(jié)核樣本、左胸結(jié)核樣本、直腸結(jié)核樣本、胸壁結(jié)核樣本、BCG菌株和結(jié)核分枝桿菌菌株，濃度在1×10³copies/mL～5×10⁵copies/mL之間。

陰性參考品共15份，包括浸潤(rùn)性腺癌樣本、肺癌樣本、慢性肺部炎癥樣本、間質(zhì)性肺炎樣本、肺鱗狀細(xì)胞癌樣本、人流感病毒A型菌株、人流感病毒B型菌株、膿腫分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、蘇加分枝桿菌和海分枝桿菌，其中菌株的濃度均為10⁶CFU/mL。

最低檢出限參考品共8份，包括肺結(jié)核樣本、非洲分枝桿菌樣本、淋巴結(jié)核樣本、骨結(jié)核樣本、右頸結(jié)核樣本、腰椎結(jié)核樣本、BCG菌株和結(jié)核分枝桿菌菌株，濃度均為1×10³copies/mL。

精密度參考品共2份，均為肺結(jié)核樣本，濃度分別為1×10⁶copies/mL和1×10⁴copies/mL。

（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

申請(qǐng)人通過(guò)對(duì)試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生產(chǎn)工藝。

申請(qǐng)人對(duì)反應(yīng)體系中的TBPCR反應(yīng)液、引物探針序列、引物探針濃度、樣本的上樣量、內(nèi)標(biāo)體系和UDG酶體系的干擾、退火溫度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)等進(jìn)行篩選和優(yōu)化，通過(guò)功能性試驗(yàn)，最終確定了最佳反應(yīng)體系。

（三）分析性能評(píng)估

該產(chǎn)品的分析性能包括核酸提取純化、準(zhǔn)確性、精密度、最低檢出限、分析特異性（交叉反應(yīng)和干擾試驗(yàn)）、包容性、不同部位組織的評(píng)估等。申請(qǐng)人提交了有效運(yùn)行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品在適用機(jī)型上的性能評(píng)估資料。

在核酸提取純化研究中，申請(qǐng)人采用臨床石蠟包埋組織樣本，平行比較了2種石蠟包埋組織核酸提取試劑盒的提取效果，根據(jù)與該產(chǎn)品的組合性能研究，確定了1種核酸提取試劑盒，與該產(chǎn)品配套使用。

在準(zhǔn)確性研究中，申請(qǐng)人采用三批試劑盒檢測(cè)15份企業(yè)陽(yáng)性參考品（1×10³copies/mL～5×10⁵copies/mL）和15份企業(yè)陰性參考品（其中菌株濃度為10⁶CFU/mL），結(jié)果顯示：陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為100%。

在精密度研究中，申請(qǐng)人采用三批試劑盒，檢測(cè)陰性樣本(不含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群)、弱陽(yáng)性樣本（濃度為2×10³copies/mL）和中等陽(yáng)性樣本（濃度為5×10⁵copies/mL），分別評(píng)估了批內(nèi)、批間、日間、不同操作者之間以及不同實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)之間的精密度。結(jié)果顯示：檢測(cè)結(jié)果Ct值的CV值均小于5%，表明本產(chǎn)品的批內(nèi)、批間、日間、不同操作者間以及不同實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)間的重復(fù)性均符合要求。同時(shí)，對(duì)低濃度的石蠟包埋組織樣本進(jìn)行提取精密度檢測(cè)，結(jié)果顯示：提取后臨床樣本的DNA濃度及純度差異較小，檢測(cè)結(jié)果Ct值的CV值均小于5%，說(shuō)明石蠟包埋組織樣本經(jīng)多次提取的DNA質(zhì)量及檢測(cè)結(jié)果一致性符合要求。

在最低檢出限研究中，申請(qǐng)人將結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌石蠟樣本分別與陰性石蠟樣本混合，采用三批成品試劑盒檢測(cè)，最終確定并驗(yàn)證了本試劑盒的最低檢出限為1×10³copies/mL。

在交叉反應(yīng)研究中，申請(qǐng)人采用三批試劑盒，對(duì)易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的病原體與可能引發(fā)臨床相似癥狀的病原菌進(jìn)行了研究，包括19種非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他分枝桿菌以及其他17種病原體。

表2非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他分枝桿菌

表3可能引發(fā)臨床相似癥狀的病原體

本產(chǎn)品對(duì)以上36種病原菌的檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。

在干擾試驗(yàn)中，申請(qǐng)人對(duì)外源及內(nèi)源干擾物質(zhì)，肺癌樣本、肺部良性疾病樣本及肺部肉芽腫樣本進(jìn)行了研究。

表4用于干擾物質(zhì)研究的外源性藥物

結(jié)果顯示：低于上述測(cè)試濃度的藥物不會(huì)對(duì)本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

對(duì)其他外源性干擾物質(zhì)10%福爾馬林（0.05v/v）、95%乙醇（0.05v/v）進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)內(nèi)源性干擾物質(zhì)血紅素（0.02g/mL）、粘液（0.05v/v）、血紅蛋白（0.2g/mL）、人基因組（2.5μg/mL）進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：低于上述濃度的干擾物質(zhì)不會(huì)對(duì)本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

采用肺癌樣本、肺部良性疾病樣本及肺部肉芽腫樣本（共20余例）分別進(jìn)行提取檢測(cè)，結(jié)果顯示：檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，以上樣本類(lèi)型不會(huì)干擾本試劑盒的檢測(cè)能力。

在包容性研究中，申請(qǐng)人采用三批試劑盒，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。結(jié)果顯示：本產(chǎn)品對(duì)結(jié)核分枝桿菌（濃度為10³copies/mL）、牛結(jié)核分枝桿菌（濃度為1×10³copies/mL）、非洲分枝桿菌（濃度為2×10³copies/mL）和田鼠分枝桿菌（濃度為2×10³copies/mL）均能100%檢出。

不同部位組織的評(píng)估：選擇不同部位的結(jié)核病組織樣本，包括睪丸結(jié)核、淋巴結(jié)核、腎結(jié)核、手指結(jié)核、胸壁結(jié)核、胸腔結(jié)核、胸椎結(jié)核、腰椎結(jié)核、右頸結(jié)核、右膝結(jié)核、直腸結(jié)核、左頸結(jié)核、左胸結(jié)核、左腰結(jié)核，提取核酸后，采用陰性樣本稀釋至最低檢出限，用三批試劑分別對(duì)其檢測(cè)20次，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，與測(cè)序結(jié)果一致。

（四）陽(yáng)性判斷值

申請(qǐng)人采用ROC曲線法確定陽(yáng)性判斷值。申請(qǐng)人采用本產(chǎn)品對(duì)237例臨床石蠟包埋組織樣本（178個(gè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性樣本和59個(gè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性樣本）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：當(dāng)靶基因通道Ct值為37左右時(shí)，本產(chǎn)品的靈敏度和特異性達(dá)到最佳。所以確定本產(chǎn)品的陽(yáng)性判斷值為37，并確定以下判讀方法：

注：高濃度樣本(Ct值≤15)，由于競(jìng)爭(zhēng)抑制，內(nèi)標(biāo)通道無(wú)S型擴(kuò)增曲線屬于正常情況，建議標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。

申請(qǐng)人采用申報(bào)產(chǎn)品對(duì)17例灰區(qū)樣本進(jìn)行復(fù)檢驗(yàn)證，結(jié)果顯示：復(fù)檢后的結(jié)果與測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果一致性可達(dá)到90%以上。

（五）穩(wěn)定性研究

申請(qǐng)人對(duì)本產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)瓶及凍融穩(wěn)定性等進(jìn)行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品的有效保存時(shí)間。同時(shí)，對(duì)石蠟包埋組織樣本的常溫放置穩(wěn)定性、石蠟包埋組織提取的DNA冷凍穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了臨床樣本的有效保存時(shí)間。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究：將三批儲(chǔ)存于-20±5℃條件下的申報(bào)產(chǎn)品經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途高溫運(yùn)輸后寄回，分別在申報(bào)產(chǎn)品生產(chǎn)后的第0、4、8、12、14個(gè)月檢測(cè)企業(yè)參考品，結(jié)果顯示：在上述各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)企業(yè)參考品的各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求。因此確定申報(bào)產(chǎn)品的效期穩(wěn)定性為：-20±5℃避光保存，有效期12個(gè)月。

三、臨床評(píng)價(jià)概述

申請(qǐng)人在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院和武漢市肺科醫(yī)院共3家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)完成了臨床試驗(yàn)。采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與Sanger測(cè)序法及病理診斷結(jié)果進(jìn)行比較研究的方法，對(duì)產(chǎn)品臨床性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。入組病例包括肺結(jié)核、肺外結(jié)核以及肺癌、非結(jié)核分枝桿菌感染、真菌感染等其他易混淆疾病患者，樣本類(lèi)型為石蠟包埋組織樣本。臨床試驗(yàn)共入組受試者604例，其中陽(yáng)性樣本400例，陰性樣本204例。試驗(yàn)結(jié)果顯示，申報(bào)產(chǎn)品與Sanger測(cè)序檢測(cè)陽(yáng)性符合率為99.25%（95%CI：97.82%，99.85%），陰性符合率為95.59%（95%CI：91.79%，97.96%）；與病理診斷對(duì)比，靈敏度為92.78%（95%CI：89.07%，95.53%），特異度為96.39%（95%CI：89.80%，99.25%）。綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)符合《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該產(chǎn)品與對(duì)比方法一致性較好，臨床性能滿(mǎn)足臨床需求。

四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定

根據(jù)申請(qǐng)人提供的申報(bào)資料，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，在目前認(rèn)知水平上，認(rèn)為該產(chǎn)品能夠較大程度地滿(mǎn)足醫(yī)療需求，預(yù)期為適用人群帶來(lái)的受益大于風(fēng)險(xiǎn)。但為保證用械安全,基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的規(guī)避，需在說(shuō)明書(shū)中提示以下信息：